Desarrollo de inmunoensayos fluorescentes para la detección de autoanticuerpos en diabetes mellitus autoinmune

Resumen

Introducción: la diabetes mellitus tipo 1 (DM1) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la destrucción selectiva de las células beta pancreáticas, mediada por autoanticuerpos específicos como GADA (anti-glutamato descarboxilasa) y ZnT8A (anti-transportador de zinc 8). La detección temprana de estos autoanticuerpos es clave para identificar individuos en riesgo y posibilitar intervenciones que prevengan o retrasen la aparición de la enfermedad clínica^1,2. Sin embargo, los métodos diagnósticos actuales, como los inmunoensayos radiométricos o enzimáticos, presentan limitaciones en sensibilidad, especificidad y requerimientos técnicos, dificultando su implementación en laboratorios de mediana o baja complejidad y en programas de tamizaje poblacional.

Objetivos: este proyecto tuvo como objetivo desarrollar inmunoensayos fluorescentes, altamente sensibles y específicos para la detección simultánea o individual de GADA y ZnT8A.

Materiales y métodos: se diseñó y produjo una proteína quimérica (ZnT8/GAD)3 que combina epítopes inmunodominantes de ambos autoantígenos, permitiendo su detección conjunta en un único ensayo. Asimismo, se evaluó una variante recombinante del antígeno GAD fusionado a tiorredoxina (TrxGAD)⁴, expresado en E. coli. La proteína quimérica fue producida en células de insecto utilizando el sistema Bac-to-Bac® y purificada mediante cromatografía de afinidad con níquel. Su correcta expresión e identidad fueron verificadas por SDS-PAGE y Western blot. En paralelo, se expresó y caracterizó TrxGAD para implementarlo en detección individual de GADA.

Resultados: se desarrolló un inmunoensayo de doble paratope con detección fluorescente, evaluado con 40 muestras de pacientes diabéticos, positivas para uno o ambos marcadores, provenientes del Laboratorio de Inmunoendocrinología (LIE), Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. El inmunoensayo mostró una especificidad del 100% -ya que todas las muestras correspondientes a individuos controles se encontraron por debajo del valor de corte arrojando señales negativas- y una sensibilidad superior al 70%. Finalmente, se realizó una comparación entre tres métodos analíticos de determinación de anticuerpos: el método radiométrico de referencia RBA, un método de fase sólida con revelado enzimático (ELISA) y el método porpuesto en este proyecto de investigación, el inmunoensayo con revelado fluorescente (IE fluorescente). Esto demostró que mediante la utilización de la molécula quimérica ZnT8/GAD junto con el ensayo fluorescente se obtienen resultados comparables con los métodos radiométricos de referencia, pero con menor complejidad técnica.

Conclusiones: se logró desarrollar un inmunoensayo fluorescente sensible, específico y técnicamente accesible para la detección de autoanticuerpos en DM1. Su implementación podría mejorar significativamente las capacidades de tamizaje y diagnóstico precoz, especialmente en contextos con recursos limitados, contribuyendo a intervenciones preventivas y a una mejor gestión clínica de la enfermedad.